<<
>>

Материалы и методы

Хитозан. Для получения низкомолекулярных форм хитозана использовали крабовый высокомолекулярный хитозан с Мг) около 700 кДа и степенью деацетилирования 85%, а также N-сукцинил хитозан с Mrj 387 кДа, производимые ЗАО «Биопрогресс» (г.

Щелково, Россия, www.bioprogress.ru). Синтезированные образцы низкомолекулярных N-сукцинил хитозана, сульфат хитозана, карбоксиметил хитозана получены в лаборатории «Инженерии ферментов», Центра «Биоинженерия» РАН, г. Москва.

Ферменты. Промышленный ферментный комплекс Целловиридин Г20х на основе штамма Trichoderma viride (Завод биологических препаратов, г.Бердск, Россия), папаин из латекса дынного дерева Carica papaya L («Sigma Chemical», США). Внеклеточный хитинолитический комплекс, продуцируемый S.kurssanovii нарабатывали самостоятельно [206].

Свиная панкреатическая липаза, тип VI-S, липаза из С. rugosa, тип VII, липаза из проростков пшеницы, тип I («Sigma Chemical», США.)

Бактериальные штаммы: В качестве продуцентов хитинолитических ферментов использовали культуру Streptomyces kurssanovii VKM Ac-1504 D (из коллекции лаборатории «Инженерии ферментов», Центра «Биоинженерия» РАН, г. Москва).

Среда для культивирования S. kurssanovii: дрожжевой экстракт - 0,1%; пептон - 0,2%; К2НРО4 • 3 Н2О - 0,3%; MgSO4 • 7 Н2О - 0,1%; хитин - 2%; pH - 6,8-7,0 [206]. Культивирование проводили в качалочных колбах

емкостью 750 мл на качалке при 28-30°С, скорость вращения 200-300 об/мин, продолжительность 96-108 часов.

Изучение антибактериальной активности экстракта из восковой моли проводили на атипичном штамме Mycobacterium smegmatis 134-S (из коллекции лаборатории «Биотехнологии стероидов», Центра «Биоинженерия» РАН, г. Москва). Клетки 'культивировали на мясо-

пептонном бульоне.

Изучение антибактериальной активности хитозана проводили на Mycobacterium avium (штамм IEKBM УААН) и Mycobacterium bovis (штамм Vallee) совместно с ВНИТИБП РАСХН (г.

Щелково). Микроорганизмы культивировали на питательной яичной среде (ННЦ «ИЭКВМ», г. Харьков).

Получение низкомолекулярного крабового хитозана. Низкомолекулярный хитозан получали путем ферментативного гидролиза высокомолекулярного хитозана, используя хитинолитический комплекс S. kurssanovii. Препарат комплекса содержал 410 мг/мл белка и 0,38 ед. хитиназной активности на 1 мл фильтрата культуральной жидкости.

Для получения низкомолекулярного хитозана 1 г исходного высокомолекулярного хитозана выдерживали в течение 6 ч при комнатной температуре в растворе, содержащем 40 мл 1 М уксусной кислоты, 10 мл 1%-ного раствора №N3 и 106 мл воды. Добавлением 1 М NaOH значение pH раствора доводили до 5,2, нагревали до 45°С и добавляли ферментный комплекс. Гидролиз проводили в течение 1 ч. Реакцию останавливали кипячением раствора в течение 10 мин. Полученный гидролизат хитозана диализовали против воды, используя диализный мешок Spectra/Por® 3,5 кДа («Spectral Medical Industries», США). Выход лиофильновысушенного низкомолекулярного хитозана составлял 80 %.

Получение крабового низкомолекулярного N-сукцинил хитозана. Низкомолекулярный N-сукцинил хитозан был получен по методике [202] с некоторыми модификациями. 4 г исходного высокомолекулярного N- сукцинил хитозана растворяли в 300 мл 0,5 Н NaOH и изменяли pH раствора до значения 6,6, добавлением 30%-ной уксусной кислоты. Раствор выдерживали 30 мин при 45°С после чего добавляли ферментный комплекс S. kurssanovii. Гидролиз проводили в течение 1,5 ч. Реакцию останавливали кипячением раствора в течение 10 мин. Полученный гидролизат хитозана фильтровали и диализовали против дистиллированной воды, используя диализный мешок Spectra/Por® 3,5 кДа. Выход лиофильно высушенного

низкомолекулярного N-сукцинил хитозана составлял 80 %.

Получение хитина и хитозана из восковой моли Galleria mellonella

Депротеинирование. Кутикулу личинок восковой моли суспендировали в воде в соотношении 1:10, добавляли 40%-ный раствор NaOH до концентрации 2%, нагревали суспензию в интервале температур до 20-100° в течение 10-180 мин при постоянном перемешивании.

ХМК отделяли на капроновом фильтре, промывали дистиллированной водой до значения pH 7.0 и высушивали при температуре 30 ± 2° в течение 24 ч. Определяли выход ХМК и БМК.

Оптимизацию процесса обесцвечивания ХМК с концентрацией суспензии 40% проводили под действием 0,5-10%-ных растворов перекиси водорода в присутствии 0,1н раствора NaOH, в интервале температур 20- 80°С и продолжительности процесса 0,5-4 ч. По окончанию процесса твердых остаток обесцвеченного хитин-меланинового комплекса отделяли фильтрованием на капроновом фильтре, промывали до pH 7,0 и высушивали в сушильном шкафу при температуре 30 ± 5°С.

Оптимизацию процесса деацетилирования обесцвеченного ХМК с концентрацией суспензии 15% осуществляли с использованием 35-55%-ных растворов NaOH в интервале температур 60-140°С в течение 0,5-4 ч при постоянном перемешивании. По окончании процесса деацетилирования реакционную массу охлаждали до 40°С и фильтровали на капроновом и стеклянном фильтрах. Полученный высокомолекулярный хитозан промывали дистиллированной водой до нейтральной реакции промывных вод и высушивали в сушильном шкафу при 30±5°С.

Гидролиз высокомолекулярного хитозана. 1 г исходного высокомолекулярного хитозана выдерживали в течение 6 часов в растворе, содержащем 40 мл 1 М уксусной кислоты, 10 мл 1%-ного раствора №N3 и 106 мл воды при комнатной температуре. Гидролиз полимера проводили под действием трех ферментативных комплексов в оптимальных условиях для каждого:

внеклеточный хитинолитический комплекс, продуцируемый S.kurssanovii: гидролиз проводили при температуре 45°С, pH 5,3 [203]. Количество культуральной жидкости необходимое для гидролиза рассчитывали по суммарному белку, содержание которого составляло 0,410 мг на мл культуральной жидкости.

- промышленный ферментный комплекс Целловиридин Г20х на основе штамма Trichoderma viride: гидролиз проводили при температуре 55°С, pH 5,3 [204] Расчет количества препарата вели исходя из содержания белка 3,7%.

- папаин из латекса дынного дерева Carica papaya L.: гидролиз проводили при температуре 37°С, pH 4,0 [117].

Расчет количества фермента вели исходя из содержания белка 70%. Для полной активации фермент предварительно растворяли в 1 мл дистиллированной воды, содержащей 5 мМ L-цистеина и 2 мМ ЭДТА.

Для ферментов используемых в процессе гидролиза, фермент- субстратное весовое соотношение составляло 1/400 (весовое отношение содержания белка в препарате к весу субстрата). Гидролиз высокомолекулярного хитозана осуществляли в течение 3 ч, отбирая аликвоты через определенные промежутки времени. Остановку гидролиза проводили кипячением в течение 10 мин. В каждом образце определяли количество восстанавливающих сахаров. Образцы гидролизованные в течение 3 ч, дополнительно диализовали против воды, лиофильно высушивали и определяли СД и Mw.

Получение экстракта из восковой моли, Galleria mellonella

Личинки восковой моли промывали изотоническим раствором NaCl. После чего, к личинкам добавляли изотонический раствор NaCl в соотношении 1:5. Гомогенизировали при 1200 об/мин в течение 10 мин и центрифугировали при температуре 4°С, на 3000 об/мин. Липидную пробку после центрифугирования прокалывали иглой Дюфо и отбирали супернатант. Хранили супернатант при температуре 4°С.

Определение хитиназной активности. Хитиназную активность определяли по количеству восстанавливающих сахаров по реакции с 3,5- динитросалициловой кислотой, используя в качестве субстрата коллоидный хитин. К 0,5 мл суспензии коллоидного хитина (концентрация 10 мг/мл) добавляли 0,5 мл 0,1 М Na-фосфатного буфера pH 6,4 и 0,5 мл фильтрата культуральной жидкости. Смесь инкубировали 15 мин при 37°С, после чего останавливали гидролиз прогреванием в течение 5 мин при 100°С. Далее фуговали 15 мин при 5000 об/мин, отбирали 0,25 мл надосадка, добавляли 0,25 мл DNSA и инкубировали в течение 5 мин при 100°С. Затем добавляли 2 мл холодной воды и проводили измерение оптической плотности на приборе «Specol-П» (Германия) при Х=582 нм. Активность рассчитывали по формуле:

А= показание прибора • 3/0,11 • 0,22 • 15 (мкмоль/мин-мл); где 15 - время реакции (мин);

0,11 - коэффициент прибора;

0,22 - молекулярный вес Ы-ацетил-В-глюкозамина;

3 - разведение реакционной среды.

Определение липолитической активности. Липолитическую активность определяли спектрофотометрически [205]. В качестве субстрата использовали паранитрофенил пальмитат, растворенный в этаноле. Реакционная смесь содержала 1 мл 0,1 М NaAc буфера (pH 6,7) и 0,05 мл 0,1% липазы из C.rugosa или 0,05 мл 5% липазы из проростков пшеницы. Концентрацию липазы из C.rugosa и проростков пшеницы определяли спектрофотометрически, используя молярные коэффициенты поглощений (Є28о)31600 [205] и 31100моль’см'1 (определеноэкспериментально).

Реакцию начинали добавлением 1 мл 0,5% раствора субстрата, перемешивали и выдерживали 10 мин при 30° С. Реакцию останавливали добавлением 2 мл 0,5 н раствора Иа2СОз, далее раствор центрифугировали в течение 10 мин при 5000 g. Изменение поглощения при 410 нм, обусловленное освобождением в результате реакции паранитрофенолята,

регистрировали спектрофотометрически. Коэффициент ЭКСТИНКЦИИ S 410 для паранитрофенолята принимали равным 15000 моль’см'1 [205]. За единицу липазной активности принимали количество фермента, необходимое для гидролиза 1 ммоль/мин паранитрофенил пальмитата в приведенных выше условиях.

Липолитическую активность в гетерогенной среде определяли путем титрования жирных кислот, образовавшихся при гидролизе оливкового масла [206]. Реакция проходила при постоянном перемешивании в 0,005 М NaAc буфере (pH 6,7) содержащем 1 мМ дезоксихолат, 1 мМ СаС12, 10 г/л твин 80, 48 г/л оливкового масла при температуре 37°С в течение 30 мин. Реакционную смесь озвучивали в течение 10 минут в ультразвуковом гомогенизаторе («Bandelin Sonorex», Германия). Реакция начиналась при добавлении в реакционную смесь 0,1% липазы из С. rugosa, 5% липазы из проростков пшеницы или 0,1% свиной панкреатической липазы. Количество образовавшихся жирных кислот определяли титрованием 0,1 н КОН. В качестве контроля использовали пробу с неактивным ферментом.

Активность липазы рассчитывали по формуле:

A=(V-V ) -10/t;

где V- объем 0,1 н КОН, затраченного на титрование свободных жирных кислот в опытной пробе, мл; V'- объем 0,1 н КОН, затраченного на титрование свободных жирных кислот в контрольной пробе, мл; 10- поправочный коэффициент [206] для пересчета одного грамма олеиновой кислоты в мкмоли; t - время реакции, мин.

Количественная характеристика эффективности ингибирования липолитических ферментов. При определении констант ингибирования липазной активности хитозан и N-сукцинил хитозан добавляли к раствору липазы в концентрации 0,63-10'3 М и 0,65-10'3 М, соответственно. Концентрация липазы в растворе составляла 0,16-10'5 М для C.rugosa и 0,6-1 О*4 М для проростков пшеницы. Смесь липазы и хитозана выдерживали

30 мин до момента добавления субстрата. Константы ингибирования Kj определяли по методу Диксона [207] из сравнения зависимостей в обратных координатах скорости реакции от концентрации субстрата, в отсутствии и в присутствии ингибитора. Концентрацию паранитрофенил пальмитата, используемого в качестве субстрата, варьировали в реакционной смеси от 1,30-10'4 до 2,65-10'3 М. Концентрацию оливкового масла, используемого в качестве субстрата для определения липолитической активности в гетерогенной среде, варьировали от 0,34-10'3 М до 2,38-10'3 М.

Определение влияния концентрации хлорида натрия на константу диссоциации комплекса хитозан-липаза. Для оценки вклада электростатических взаимодействий между положительно заряженными аминогруппами хитозана и отрицательно заряженными группами белка в образование комплекса хитозан-липаза, измеряли зависимость константы ингибирования липазы хитозаном от концентрации добавленного в раствор хлорида натрия. Влияние концентрации соли NaCl на константу диссоциации комплекса может быть описано уравнением [208]:

log Kj /log [Cl ] = - n;

где n равно числу противоионов заряженных аминогрупп хитозана освобождаемых при его связывании с липазой.

Определение суммарного количества белка проводили по методу Брэдфорд [209]. В пробирке смешивали 750 мкл раствора, содержащего определяемый белок, с равным объемом раствора красителя (Coomassie Brilliant Blue G-250 в 3% НСЮ4). Растворы выдерживали 15-20 мин до развития фиолетовой окраски. Далее измеряли поглощение раствора белка при X—600 нм относительно контрольного раствора. В качестве стандарта использовали бычий сывороточный альбумин («Sigma», США).

Фракционирование низкомолекулярного хитозана. Полученные гидролизаты низкомолекулярного хитозана фракционировали методом дробной экстракции в системе этиловый спирт - вода [204]. Навеску 100 мг суспендировали в 10 мл 96 % этилового спирта при перемешивании в

течение 30 мин. Осадок отфильтровывали и повторно суспендировали в системе этиловый спирт - вода (7,5:2,5; 5:5; 2,5:7,5 и 0:10). Фильтраты после каждой экстракции концентрировали, лиофильно высушивали и определяли СД и Mrj. Оставшийся после многократной экстракции осадок дважды промывали водой и высушивали в виде суспензии.

Определение степени деацетилирования хитозана. Степень деацетилирования хитозана определяли методом кондуктометрического титрования [204]. Навеску образца хитозана (50-200 мг) растворяли в 100 мл 0,02 М НС1. Полученный раствор титровали 0,1 М NaOH, добавляя по 0,1 мл через каждые 30 секунд, при постоянном перемешивании. Количество щелочи, необходимое для титрования связанной с аминогруппами кислоты, определяли из графика зависимости электропроводности раствора от объёма щёлочи. Расчет СД вели по формуле:

CA=Mx V-N/P+(Mx-Mxm) V N= 203 V N/P+42 -V-N; где Мх - молекулярная масса звена хитина;

Мхт - молекулярная масса звена хитозана;

V -объём NaOH, необходимый для титрования связанной с аминогруппами кислоты, определяемая из графика, мл;

N - нормальность NaOH; р - навеска хитозана, мг.

Определение средневязкостной молекулярной массы хитозана. Средневязкостную молекулярную массу хитозана рассчитывали из уравнения Марка-Хаувинка для хитозанов с различной степенью деацетилирования [210]:

ц = к-М“;

где ц - характеристическая вязкость, дл/г; к и а - константы, рассчитывающиеся по формулам: к = 1,64-10’3°-СД14;

а = -1,0240'2*СД+1,82;

СД - степень деацетилирования, %.

Измерение вязкости растворов хитозана проводили в вискозиметре Уббелоде с диаметром капилляра 0,5 мм при температуре 30°С. В качестве растворителя использовали 0,2 М раствор уксусной кислоты и 0,1 М раствор ацетата натрия в соотношении 1:1 по объёму. В основе метода лежит измерение времени истечения раствора полимера с последовательно уменьшающейся концентрацией его в растворе [211]. Величины удельной (Цуд) и приведённой (цпр) вязкости растворов хитозана рассчитывали по формулам:

Луд ~~ то! то,

Лпр— Луд ! с»

где ті - время истечения раствора полимера, сек; то - время истечения растворителя, сек; с - концентрация раствора, %.

Характеристическую вязкость г| находили как точку пересечения экстраполированной к нулевой концентрации хитозана прямой зависимости Лпр ~ Лпр (с)-

Хроматографический анализ хитозана. Методом гель-проникающей хроматографии на приборе «Sykam» (Германия) определяли средневесовую молекулярную массу Mw, среднечисловую молекулярную массу Мп и значение полидисперсности Ip (Ip=Mw/Mn) образцов хитозана. Хроматографический анализ проводили с использованием тандема колонок Ultrahydrogel 250 (7,8x300 мм) и Ultrahydrogel 500 (8x300 мм) («Waters Chromatography», США), в системе 0,2 М уксусной кислоты и 0,15 М ацетата аммония, pH 4,4, при температуре 30°С и скорости элюции 0,5 мл/мин. Контроль и анализ хроматограмм осуществляли с помощью программы «Мультихром» версия 1.6 (ЗАО Амперсенд, Россия). Для калибровки колонки использовали декстрановые стандарты различной молекулярной массы для гель-проникающей хроматографии («Sigma», США).

Для определения антибактериальной активности экстракта

выделенного из восковой моли использовали штамм M.smegmatis 134-S. Бактерии выращивали на мясо-пептонном бульоне в колбах на качалке (100 об/мин) в течение 72 часов, при температуре 37°С. Для определения чувствительности микобактерий (процент гибели) в пробирки вносили тестируемую фракцию экстракта (из расчета 0,1 мг/мл белка) и ресуспендировали в изотоническом растворе NaCl до титра ~ 108 кл/мл. Реакционную смесь инкубировали в течение 1,5 часов при 37°С на качалке. Методом титрования определяли количество выживших клеток и рассчитывали процент их гибели.

Антибактериальная активность хитозана в отношении штаммов М. avium и М. bovis

Штаммы М. avium и М. bovis использовали для определения чувствительности (гибели клеток) к действию образцов хитозана с Мг| 38 (СД 78%), 58 и 87 кДа (СД 80% и 84%, соответственно) и N-сукцинил хитозана с Мг| 380 кДа, в концентрации 0,1 %. Для этого готовили 0,1 % раствор хитозана (pH 6,8) и добавляли его к питательной яичной среде, после чего, коагулировали при температуре 90°С в течение 60 минут. Затем высевали 0,5 мл микробной суспензии на чашку Петри с питательной средой содержащей хитозан или без хитозана (контроль). Посевы с клетками М. avium культивировали в течение 14 дней при температуре 37°С, а посевы с клетками М. bovis в течение 28 дней при температуре 37°С.

Определение МИК хитозана в отношении клеток М. smegmatis

Для определения МИК каждый образец хитозана титровали методом двукратных серийных разведений в полистирольных планшетах - ряд из 12 лунок. Начиная со второй лунки, вносили по 100 мкл стерильного изотонического раствора NaCl. В первую пустую лунку вносили 100 мкл исходного 1%-ного хитозана. Таким образом, начиная со второй лунки, 100 мкл хитозана с определенной концентрацией разводили до конца ряда (двукратными разведениями); из последней лунки 100 мкл смеси удаляли. Далее готовили микробную суспензию из расчета 5х 107 кл/мл (стандарт № 5

ГИСК им. Л.А. Тарасевича). В каждую лунку ряда вносили 10 мкл микробной суспензии. Использовали 12 опытных и 2 контрольные лунки. В качестве первого контроля служила смесь из 100 мкл изотонического раствора NaCl и 10 мкл микробной суспензии. Второй контроль содержал 100 мкл 1%-ного раствора хитозана без добавления микробной суспензии.

Планшеты со смесью разведенных образцов хитозанов с тест-культурой инкубировали в течение 4 часов при 37°С, и затем высевали на чашки Петри с МПА. Параллельно, делали высевы на чашки Петри и из контрольных лунок. После инкубации учитывали наличие или отсутствие роста М. smegmatis при соответствующих разведениях тестируемых образца хитозана.

Определение прочности связывания хитозана с поверхностью клеточной стенки М. smegmatis проводили в супернатанте с помощью колориметрического метода при длине волны 565 нм на спектрофотометре «Specol-П» («Carl Zeiss Jena», Германия). Метод основан на взаимодействии основных аминогрупп хитозана с нингидрином. В качестве контроля использовали раствор из контрольного варианта опыта [129].

Фракционирование экстракта выделяемого из восковой моли

Первым этапом разделения отобранного супернатанта было дробное сульфат аммонийное осаждение (30-85 % насыщения). Полученные фракции фуговали в течение 10 мин, на 5000 об/мин, диализовали при температуре 4°С в течение 12 часов. В каждой полученной фракции определяли липолитическую активность (в качестве субстрата использовали паранитрофенил пальмитат) и антибактериальную активность в отношении атипичного штамма М. smegmatis. Фракцию с максимальной антибактериальной активностью разделяли путем колоночной хроматографии - гидрофобной и металл-хелат аффинной.

Гидрофобная хроматография (ГХ). Колонку (1,2 х 3 см) с сорбентом (бутил-тойоперл 650) уравновешивали 0,05 М Na-фосфатным буфером, pH

7.3, содержащим 0,9 М Na2SO4. Экстракт наносили на колонку со скоростью 15 мл/ч. После нанесения и промывания уравновешивающим буфером белки

элюировали в ступенчатом градиенте концентрации 0,3 Ми 0,1 М Na2SO4. Фракция с максимальной антибактериальной активностью элюировалась в буфере с 0,1 М Na2SO4. Далее очистку этой фракции проводили на тандеме колонок с №(И)-ИДК- Си(И)-ИДК агарозой.

Металл-хелат аффинная хроматография (МХАХ). На тандем колонок с №(П)-ИДК-агарозой (1x4 см) и с Си(Н)-ИДК агарозой (1,4 х 3 см) уравновешенных 0,05 М Na-фосфатным буфером, pH 7.3, с 0,2 М NaCl наносили фракцию с максимальной антибактериальной активностью после гидрофобной хроматографии со скоростью 20 мл/ч. После элюции балластных белков 0,05 М Na-фосфатным буфером, pH 7.3, с 0,2 М NaCl, колонки разъединяли. Элюцию белков с колонки, заряженной ионами меди, проводили последовательным добавлением 0,05 М и 0,25 М имидазола. Фракция обладающая максимальной липолитической и антибактериальной активностями элюировалась в буфере с добавлением 0,05 М имидазола.

Электрофорез в денатурирующих условиях в 12%-ном полиакриламидном геле проводили по методу Леммли [212] на приборе Mini Protein II («Віо-Rad», США). Использовали набор маркеров с молекулярной массой в диапазоне 14,4 - 97 кДа («Sigma», США).

Статистический анализ проводили с использованием стандартных математических методов в компьютерной программе «Microsoft-Excel».

3.

<< | >>
Источник: ОСТАНИНА ЕКАТЕРИНА СЕРГЕЕВНА. ТЕХНОЛОГИЯ ПЕРЕРАБОТКИ ВОСКОВОЙ МОЛИ, ИЗУЧЕНИЕ ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНЫХ СВОЙСТВ ХИТОЗАНА И ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С ЛИПОЛИТИЧЕСКИМИ ФЕРМЕНТАМИ. Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук. Щёлково - 2007. 2007

Еще по теме Материалы и методы:

  1. 2.2. Материалы и методы исследования
  2. Глава 2 Материалы и методы
  3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
  4. Материалы и методы исследования
  5. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
  6. ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
  7. Методы статистической обработки материалов исследования
  8. Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
  9. Материалы и методы исследований
  10. 2.1. Материалы и методы исследований
  11. 3.2 Материалы и методы исследования
  12. Материалы и методы исследования
  13. ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
  14. ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
  15. Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
  16. ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ